Absolutní Kvantifikace Sérového Proteomu

Jeffrey J. Porter, Justin Wildsmith, Christopher D. Melm, Mark D. Schuchard, Kevin M. Ray, Dian Er Chen, a Graham B. I. Scott

ke Stažení pdf verze. (1.96 mb PDF)

Abstrakt
Úvod
Plazmové Fakta
Metody
Výsledky
Závěry

Abstrakt

Plazmové proteomika drží velký příslib pro budoucnost biomarker discovery, stejně jako in vitro diagnostika. Ačkoli plazma je snadno dostupná pro analýzu, studium plazmatického proteomu je zásadně omezeno jeho obrovským dynamickým rozsahem (10 řádů). Proteiny s nízkým množstvím, nesoucí velký diagnostický potenciál, jsou často zakryty přítomností vysoce hojných sérových proteinů. Abychom tento problém vyřešili, vyvinuli jsme proteoprep® 20, pryskyřici na bázi protilátek schopnou vyčerpat 97-98% celkového proteinu z plazmy. Deplece těchto proteinů s vysokou hojností umožňuje vizualizaci proteinů koelutujících s proteiny a peptidy s vysokou hojností a maskovaných pomocí metod LC-MS. Absolutní Kvantifikace (Protein-AQUA™) je cílené kvantitativní proteomika technika, která vykazuje robustní účinnost a je stále více využívána pro širokou škálu kvantitativní proteomika studium. Použitím ProteoPrep® 20 pro depleci nejhojnějších proteinů jsme umožnili identifikaci a absolutní kvantifikaci četných proteinů s nižším množstvím z lidského séra. Věříme, že to může potenciálně poskytnout multiplexovaný cílený přístup k objevu proteinů, které mají biologický nebo diagnostický význam.

zpět na začátek

Úvod

studium lidského proteomu plazmy je oblast velký zájem, a to zejména pro farmaceutický potenciál identifikace biomarkerů onemocnění. Mnoho proteinů farmaceutického zájmu se objevuje v nízkých koncentracích v plazmě, a proto je obtížné je detekovat. Identifikace potenciálních biomarkerů je obzvláště obtížná kvůli přítomnosti proteinů s vyšší hojností. Deplece těchto proteinů s vysokou hojností umožňuje vizualizaci proteinů koelutujících s proteiny a peptidy s vysokou hojností a maskovaných pomocí metod LC-MS. Odstraněním proteinů s vysokou hojností, vyšší zatížení plazmatických proteinů s nižší hojností pak může být odděleno na sloupcích reverzní fáze, což umožňuje detekci a kvantifikaci proteinů s nízkým počtem kopií. ProteoPrep® 20 plazmatická Imunodeplece Kit byl vyvinut pro odstranění 20 vysoce hojných proteinů z 8 mL plazmy. Vyčerpání těchto 20 vysoké množství bílkovin odstraňuje větší než 97% bílkovin v plazmě a umožňuje analýzu 20 – až 50-krát více jednotlivých bílkovin pro lepší vizualizaci nižší počet kopií proteinů. Použitím ProteoPrep® 20 pro depleci 20 nejhojnějších proteinů jsme umožnili identifikaci a absolutní kvantifikaci četných proteinů s nižším množstvím z lidského séra.

zpět na začátek

Plazmové Fakta

  • 10 nejhojnější proteiny představují přibližně 90% z celkové hmotnosti proteinu v lidské plazmě.
  • o 22 nejhojnějších proteinech se říká, že představují přibližně 99% celkové hmotnosti proteinu v lidské plazmě.
  • kolona plazmatické imunodeplece ProteoPrep® 20 odstraňuje 20 vysoce hojných plazmatických/sérových proteinů uvedených níže. Těchto 20 proteinů představuje přibližně 97% celkové hmotnosti bílkovin v lidské plazmě.

20 Most Abundant Plasma Proteins
Albumin α-2-Macroglobulin Apolipoprotein A1 Complement C4
IgGs IgMs Apolipoprotein A2 Complement C1 q
Transferrin α-1-Antitrypsin Apolipoprotein B IgDs
IgAs Haptoglobin Ceruloplasmin Plasminogen

zpět na začátek

Metody

Vysoké Množství Bílkovin Vyčerpání
Dvacet vysoké množství proteinů byly vyčerpány z plazmy s použitím ProteoPrep® 20 Immunodepletion Kit (PROT20). Byla použita velká 3,7 mL prototypová spinová kolona schopná vyčerpat 100 mL lidské plazmy. Koncentrace proteinu v celé a ochuzené plazmě byla stanovena pomocí Bradfordova testu (B6916), přičemž standardem byla BSA.
Tryptické trávení
vzorky celé i ochuzené plazmy byly připraveny v alikvotech 100 mg. Každý vzorek byl zředěn na 0,25 mg / mL v pufru hydrogenuhličitanu amonného. Acetonitril byl přidán do konečné koncentrace 9% (v/v) a každý vzorek byl snížen a alkylovaná s použitím ProteoPrep® Redukce/Alkylace Kit (PROTRA). Proteomika Stupeň Trypsin (T6567) byl přidán v koncentraci 1% (w/w) a vzorek se inkubuje po dobu 3 hodin při 37 °C. další poměrné části trypsin v 1% (w/w) byl přidán a pak vzorek se dále inkubuje se při 37 °C přes noc. Digesty byly vysušeny až do dokončení v SpeedVac™.
LC-MS/MS Analýzy
injekce tryptically stravitelné ProteoPrep® 20 vyčerpané plazmy vzorku (připraveného jak je popsáno v Metodách) byla provedena pomocí Agilent kapilární 1100 HPLC. Separace reverzní fáze byla provedena na koloně Discovery C18 o rozměrech 15 cm × 2,1 mm za použití 3hodinového gradientu. Mobilní fáze sestávala z mravenčí okyselené vody a acetonitrilu. Separační systém byl spojen s Thermo Finnigan LTQ lineární iontové pasti hmotnostního spektrometru nastaveny provádět tandemové MS na deset nejhojnější ionty v každém full scan spektra. Po získání výsledků tandemového MS na zajímavém iontu, byl přidán do seznamu vyloučení, aby se usnadnil výslech iontů s nižší hojností. Na LC-SRM metoda byla vyvinuta odpovídající cíle bílkovin albumin (ideotypic peptid = FQNALLVR) a gelsolin (ideotypic peptid =GASQAGAPQGR), jak je popsáno v sekci Výsledky.
AQUA Analýzy
AQUA™ Peptide zásobní roztok byl připraven rozpuštěním značené isotopy verze dvě cílové peptidy (FQNALLVR* a GASQAGAPQGR*, v tomto pořadí) v 0,1% TFA do finální koncentrace 62.5 fmol/mL. Každý vzorek digestu (celá a vyčerpaná plazma) byl rozpuštěn ve 20 mL zásobního roztoku peptidu AQUA™. Vzorky byly analyzovány pomocí Agilent kapilární 1100 HPLC ve Thermo Finnigan LTQ lineární iontové pasti hmotnostního spektrometru. Pomocí metody LC-SRM bylo stanoveno absolutní množství každého peptidu (a odpovídajícího proteinu).

back to top

Results

Select an optimal tryptic peptide and stable isotope amino acid from the sequence of your protein of interest.
Order synthetic AQUA™ Peptide from.
Optimize LC-MS/MS separation protocol for quantitation.
Extract protein from biological samples and add known quantity of AQUA™ peptide.
Digest.
analyzovat pomocí LC-MS / MS nebo MALDI kvantifikovat protein zájmu.

Obrázek 1: Přehled metody Protein-AQUA™. Tuto metodu vyvinul Dr. Steve Gygi a kolegové z Harvard Medical School . Omezené použití této metody je povoleno na základě licenční dohody s Harvard Medical School.

klikněte na obrázek pro zvětšení.

Obrázek 2: Vývoj proteinu-AQUA™ LC-SRM pro absolutní kvantifikaci proteinů. Injekce tryptically stravitelné ProteoPrep® 20 vyčerpané plazmy vzorku (připraveného jak je popsáno v Metodách) byla provedena pomocí Agilent kapilární 1100 HPLC ve Thermo Finnigan lineární iontové pasti hmotnostního spektrometru. Chromatogram základního píku (obrázek 2A) ukazuje složitou směs druhů, které mohou nebo nemusí být chromatograficky vyřešeny. Využitím síly tandemového MS bylo s jistotou pozitivně identifikováno více než 100 proteinů z ochuzeného vzorku plazmy. Dva z těchto proteinů (albumin a gelsolin) byly vybrány pro další studium. Úplné skenování MS znázorněné na obrázku 2B ilustruje vysokou hojnost 481 Da dvojnásobně nabitého iontu z jednoho z identifikovaných albuminových peptidů. Tato sekvence je pak potvrzena na obrázku 2C s množstvím iontů y a b. Tento experimentální přístup vytváří základy pro výběr vhodného peptidu AQUA™ a poskytuje potřebné informace pro návrh experimentu SRM. Jak je znázorněno na Obrázcích 2B a 2C, dvojnásobně nabitý rodič ion této konkrétní albumin peptid vybrán pro fragmentaci a dva nejhojnější y-ionty přítomné v tandemu MS byly vybrány pro detekci.

back to top

Protein Identification XC Score Coverage (%) Protein Identification XC Score Coverage (%)
1 1 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 120 21 30 Neuronal kinesin heavy chain 10 16
2 Apolipoprotein A-IV precursor 90 47 31 WIP-related protein 10 24
3 Alpha-1-antichymotrypsin precursor 40 24 32 ATP-binding cassette sub-family F 10 15
4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 40 15 33 NAD(P)H dehydrogenase 1 10 6
5 Afamin precursor 40 24 34 Inhibin beta A chain precursor 10 33
6 Kininogen-1 precursor 40 23 35 Corticosteroid-binding globulin precursor 10 2
7 Complement factor H precursor 30 16 36 Neuropeptide FF receptor 1 10 8
8 Serum amyloid P-component precursor 30 35 37 Tripartite motif protein 8 9
9 Histidine-rich glycoprotein precursor 20 15 38 CD180 antigen precursor 8 5
10 Antithrombin-III precursor 20 23 39 CCAAT displacement protein 8 13
11 Gelsolin precursor 20 15 40 Cytoplasmic linker protein 8 15
12 Hemopexin precursor 20 30 41 Eukaryotic translation initiation factor 2 8 25
13 Vitronectin precursor 20 27 42 Sodium channel protein type I alpha subunit 8 5
14 Alpha-2-antiplasmin precursor 20 24 43 Signal peptide peptidase-like 2B 8 9
15 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 20 32 44 Acid ceramidase precursor 8 28
16 Angiotensinogen precursor 10 12 45 Glutamate receptor, ionotropic kainate 3 8 16
17 AMBP protein precursor 10 9 46 Gephyrin 8 14
18 Alpha-2-HS-glycoprotein precursor 10 25 47 ARD1 subunit homolog 8 33
19 F-box only protein 31 10 17 48 Low-density lipoprotein receptor protein 2 8 6
20 Prothrombin precursor 10 14 49 Troponin I, fast skeletal muscle 8 15
21 Plasma protease C1 inhibitor precursor 10 8 50 Integrin alpha-E precursor 8 10
22 Tubulin tyrosine ligase-like protein 4 10 7 51 TSC22 domain family protein 1 6 25
23 Heparin cofactor II precursor 10 11 52 Secretogranin-3 precursor 6 12
24 Beta-2-glycoprotein I precursor 10 17 53 BRCA1-associated protein 6 12
25 Isovaleryl-CoA dehydrogenase 10 8 54 Reelin precursor 4 4
26 BLOC-1 subunit 10 14 55 Threonine synthase-like 1 4 19
27 Pantothenate kinase 3 10 14 56 Ciliary dynein heavy chain 5 2 12
28 Contactin 3 precursor 10 8 57 Sorting nexin-19 2 9
29 Komplementu C5 předchůdce 10 9

Tabulka 1: Proteiny Identifikované v LC-MS/MS Analýza ProteoPrep® 20 Úbytku Vzorku (není identifikován v celé plazmě analýza). Výše uvedené proteiny byly s jistotou identifikovány ve vzorku Ochuzeném ProteoPrep® 20 a nebyly detekovány v celé plazmatické LC-MS/MS analýze. Pomocí technologie ProteoPrep® 20 deplece jsme umožnili identifikaci a absolutní kvantifikaci těchto proteinů. Datové sady byly prohledávány pomocí algoritmu SEQUEST v Bioworks 3.2. Filtrace bílkovin hity se skládala z XCORR hodnoty >1.9, 2.2, a 3.75 pro jednotlivě, dvojnásobně a trojnásobně nabité ionty, stejně jako delta KN > 0,1 a Rsp > 4.

zpět na začátek

obrázek 3: Protein-AQUA™ analýza albuminu v celé plazmě a ProteoPrep® 20 Depleted vzorky. Vybrané monitorování reakcí (SRM) se specificky zaměřuje na detekci MS vybraného rodiče, který produkuje specifické dceřiné ionty. Údaje 3A (celý plazmě) a 3C (ochuzený) líčí endogenní albumin peptid, FQNALLVR, jako dvojnásobně nabité ionty fragment vyrábět dva bohaté y-iontů. Tyto stejné y-ionty jsou monitorovány v peptidovém standardu AQUA™ znázorněném na obrázcích 3B (celá plazma) a 3D (ochuzené); absolutní hmotnost k náboji rodičovských i dceřiných iontů v AQUA spike však má vyšší hmotnost díky začlenění stabilní izotopové aminokyseliny. Kvantifikace se provádí integrací koelutujících vrcholových oblastí zobrazených zde za 34,8 minut. Analýza vzorků Protein-AQUA™ ukazuje 99,8% depleci albuminu pomocí plazmatické Imunodepleční soupravy ProteoPrep® 20, která je ve vynikající shodě s dříve získanými údaji ELISA.

zpět na začátek

obrázek 4: Protein-AQUA analýza Gelsolinu v celé plazmě a ProteoPrep® 20 ochuzených vzorků. SRM Analýza endogenních gelsolin peptid, GASQAGAPQGR, výsledky v komplexu chromatogramu v celé plazmě (Obrázek 4A) s špatné rozlišení a nízkou signál-šum. Když analyzoval ve vytěžených plazmy (Obrázek 4C), endogenní gelsolin peptid je snadno se oddělí od rušivých druhů a jeho koncentrace snadno vypočítat v porovnání s AQUA™ peptide vnitřního standardu (Obr. 4B a 4D).

zpět na začátek

závěry

plazmatická proteomika je velkým příslibem pro budoucnost objevu biomarkerů i diagnostiku in vitro. Ačkoli plazma je snadno dostupná pro analýzu, studium plazmatického proteomu je zásadně omezeno jeho obrovským dynamickým rozsahem (10 řádů). Proteiny s nízkou hojností, nesoucí velký diagnostický potenciál, jsou často zakryty přítomností vysoce hojných sérových proteinů. Použitím ProteoPrep® 20 pro depleci nejhojnějších proteinů jsme umožnili identifikaci a absolutní kvantifikaci četných proteinů s nižším množstvím z lidského séra. Věříme, že tato kombinace technologií může potenciálně poskytnout multiplexní cílený přístup k objevu bílkoviny hospodářství, biologické nebo diagnostický význam.

zpět na začátek

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.