Seerumiproteomin absoluuttinen kvantifiointi

Jeffrey J. Porter, Justin Wildsmith, Christopher D. Melm, Mark D. Schuchard, Kevin M. Ray, Dian Er Chen ja Graham B. I. Scott

Lataa PDF-versio. (1,96 mb PDF)

Abstrakti
Johdanto
Plasmafaktat
menetelmät
tulokset
johtopäätökset

Abstrakti

Plasmaproteomiikka pitää hyvin lupaavana biomarkkerien löytämisen sekä in vitro-diagnostiikan tulevaisuuden. Vaikka plasma on helposti analysoitavissa, plasman proteomin tutkimista rajoittaa olennaisesti sen laaja dynaaminen alue (10 suuruusluokkaa). Runsasmääräiset proteiinit, joilla on suuri diagnostinen potentiaali, ovat usein hämärän peitossa runsasmääräisten seerumiproteiinien vuoksi. Ongelman ratkaisemiseksi olemme kehittäneet ProteoPrep® 20: n, vasta-ainepohjaisen hartsin, joka pystyy tyhjentämään 97-98% plasman kokonaisproteiinista. Näiden runsasproteiinien ehtyminen mahdollistaa runsasproteiinien ja peptidien kanssa eluoituvien ja niiden peittämien proteiinien visualisoinnin LC-MS-menetelmiä käyttäen. Absoluuttinen Kvantitatiivisuus (Protein-AQUA™) on kohdennettu kvantitatiivinen proteomiikan tekniikka, joka osoittaa vankkaa tehoa ja jota käytetään yhä enemmän monenlaisissa kvantitatiivisissa proteomiikan tutkimuksissa. Käyttämällä ProteoPrep® 20: tä runsaimpien proteiinien ehtymiseen, olemme mahdollistaneet lukuisten vähemmän runsaiden proteiinien tunnistamisen ja absoluuttisen kvantifioinnin ihmisen seerumista. Uskomme, että tämä voi mahdollisesti tarjota multipleksoidun kohdennetun lähestymistavan sellaisten proteiinien löytämiseen, joilla on biologista tai diagnostista merkitystä.

back to top

Introduction

ihmisen plasmaproteomin tutkimus on erittäin kiinnostava alue erityisesti sairauden biomarkkerien tunnistamisen farmaseuttisen potentiaalin kannalta. Monia farmaseuttisesti tärkeitä proteiineja esiintyy plasmassa pieninä pitoisuuksina, minkä vuoksi niitä on vaikea havaita. Potentiaalisten biomarkkereiden tunnistaminen on erityisen vaikeaa runsaampien proteiinien vuoksi. Näiden runsasproteiinien ehtyminen mahdollistaa runsasproteiinien ja peptidien kanssa eluoituvien ja niiden peittämien proteiinien visualisoinnin LC-MS-menetelmiä käyttäen. Poistamalla runsasmääräiset proteiinit voidaan suuremmat kuormitukset vähemmän runsaita plasmaproteiineja erottaa käänteisfaasikolonneilla, jolloin voidaan havaita ja kvantifioida vähäiset kopioproteiinit. ProteoPrep® 20 Plasma Immunodepletion Kit on kehitetty poistamaan 20 runsaasti proteiinia 8 mL: sta plasmaa. Näiden 20 runsaasti proteiinia sisältävän proteiinin ehtyminen poistaa yli 97% plasman proteiineista ja mahdollistaa 20 – 50 kertaa suuremman analyysin jokaisesta yksittäisestä proteiinista pienempien kopioproteiinien visualisoinnin parantamiseksi. Käyttämällä ProteoPrep® 20: tä 20 runsaimman proteiinin poistumiseen, olemme mahdollistaneet lukuisten vähemmän runsaiden proteiinien tunnistamisen ja absoluuttisen kvantifioinnin ihmisen seerumista.

takaisin alkuun

plasman faktat

  • 10 runsainta proteiinia edustavat noin 90% ihmisen plasman kokonaisproteiinimassasta.
  • 22 runsaimman proteiinin sanotaan edustavan noin 99% ihmisen plasman kokonaisproteiinimassasta.
  • proteoprep® 20 plasma immunodepletion-sarake poistaa alla luetellut 20 runsaasti plasmaa / seerumia sisältävää proteiinia. Nämä 20 proteiinia edustavat noin 97% ihmisen plasman kokonaisproteiinimassasta.

20 Most Abundant Plasma Proteins
Albumin α-2-Macroglobulin Apolipoprotein A1 Complement C4
IgGs IgMs Apolipoprotein A2 Complement C1 q
Transferrin α-1-Antitrypsin Apolipoprotein B IgDs
IgAs Haptoglobin Ceruloplasmin Plasminogen

takaisin alkuun

menetelmät

Runsasproteiinikato
kaksikymmentä runsasproteiinia hupeni plasmasta käyttäen proteoprep® 20 immunodepletion Kit (prot20). Käytettiin suurta 3,7 mL: n prototyyppistä spin-kolonnia, joka kykeni tyhjentämään 100 mL ihmisen plasmaa. Kokonaisen ja tyhjentyneen plasman proteiinipitoisuus määritettiin Bradford assaylla (B6916), jossa standardina oli BSA.
Tryptic Digestion
näytteet sekä kokonaisesta että köyhdytetystä plasmasta valmistettiin 100 mg: n alikiintiöinä. Jokainen näyte laimennettiin 0, 25 mg/mL: aan ammoniumbikarbonaattipuskurissa. Asetonitriiliä lisättiin lopulliseen 9%: n pitoisuuteen (v/v), ja jokainen näyte pelkistettiin ja alkyloitiin ProteoPrep® – pelkistys – / Alkylointisarjalla (PROTRA). Proteomics Grade trypsiiniä (T6567) lisättiin 1%: n pitoisuutena (w/w), ja näytettä inkuboitiin 3 tuntia 37 °C: ssa.lisäksi lisättiin määräosa 1%: n trypsiiniä (w/w), minkä jälkeen näytettä inkuboitiin 37 °C: ssa yön yli. Mädät kuivattiin valmiiksi SpeedVac™ – laitteessa.
LC-MS / MS-analyysi
tryptisesti pilkottu ProteoPrep® 20-tyhjentynyt plasmanäyte (valmistettu menetelmien mukaisesti) injektoitiin Agilentilla kapillaarilla 1100 HPLC. Käänteisfaasierotus suoritettiin 15 cm × 2,1 mm Discovery C18-kolonnilla käyttäen 3 tunnin gradienttia. Liikkuva faasi koostui muurahaishappoisesta vedestä ja asetonitriilistä. Erotusjärjestelmä kytkettiin Thermo Finnigan LTQ-lineaariseen ioniloukun massaspektrometriin, joka oli asetettu suorittamaan tandem MS-testi kymmenelle runsaimmalle Ionille kussakin täyden skannauksen spektrissä. Saatuaan tandem MS-tulokset kiinnostavasta ionista, se lisättiin poissulkuluetteloon helpottamaan vähemmän runsaiden ionien kuulustelua. On kehitetty LC-SRM-menetelmä, joka vastaa proteiinikohteita albumiinia (ideotyyppinen peptidi = fqnallvr) ja gelsoliinia (ideotyyppinen peptidi =GASQAGAPQGR), kuten tulokset-osiossa on esitetty.
AQUA-analyysi
Aqua™ – Peptidikantaliuos valmistettiin liuottamalla isotopisesti merkittyjä versioita kahdesta kohdepeptidistä (FQNALLVR* ja gasqagapqgr*) 0, 1%: ssa TFA: ta lopulliseksi pitoisuudeksi 62, 5 fmol/mL. Jokainen digest-näyte (kokonainen ja tyhjentynyt plasma) liuotettiin 20 mL: aan Aqua™ – Peptidikantaliuosta. Näytteet analysoitiin Agilentilla kapillaari 1100 HPLC: llä yhdistettynä Thermo Finnigan LTQ linear ion trap-massaspektrometriin. LC-SRM-menetelmällä määritettiin kunkin peptidin (ja vastaavan proteiinin) absoluuttinen määrä.

back to top

Results

Select an optimal tryptic peptide and stable isotope amino acid from the sequence of your protein of interest.
Order synthetic AQUA™ Peptide from.
Optimize LC-MS/MS separation protocol for quantitation.
Extract protein from biological samples and add known quantity of AQUA™ peptide.
Digest.
analysoi LC-MS / MS: n tai MALDIN avulla, jotta saadaan kvantitoitua kiinnostava proteiini.

kuva 1: katsaus Protein-AQUA™ – menetelmään. Tämän menetelmän kehitti tohtori Steve Gygi kollegoineen Harvard Medical Schoolissa . Tämän menetelmän rajoitettu käyttö on sallittua Harvard Medical Schoolin kanssa tehdyn lisenssijärjestelyn nojalla.

klikkaa kuvaa suuremmaksi.

kuva 2: Protein-Aqua™ LC-SRM: n kehittäminen absoluuttisen proteiinin kvantifiointia varten. Tryptisesti pilkottu ProteoPrep® 20-loppusijoitettu plasmanäyte (valmistettu menetelmien mukaisesti) ruiskutettiin Agilentilla kapillaarisella 1100 HPLC: llä, joka oli kytketty Thermo Finnigan linear ion trap-massaspektrometriin. Emäshuippukromatogrammi (Kuva 2A) esittää monimutkaisen lajiseoksen, joka on kromatografisesti selvinnyt tai ei ole selvinnyt. Käyttämällä tandem MS: n voimaa yli 100 proteiinia tunnistettiin varmuudella tyhjentyneestä plasmanäytteestä. Kaksi näistä proteiineista (albumiini ja gelsoliini) valittiin jatkotutkimuksiin. Kuvassa 2b esitetty täydellinen ms-kuvaus kuvaa 481 Da: n kaksinkertaisesti varautuneen ionin runsautta yhdestä havaitusta albumiinipeptidistä. Tämä sekvenssi vahvistetaan sitten Kuvassa 2C, jossa on runsaasti y – ja b-ioneja. Tämä kokeellinen lähestymistapa luo perustan sopivan Aqua™ – peptidin valitsemiselle sen lisäksi, että se tarjoaa tarvittavat tiedot SRM-kokeen suunnittelua varten. Kuten kuvista 2b ja 2C käy ilmi, tämän spesifisen albumiinipeptidin kaksin varautunut kanta-ioni valittiin pirstoutumaan ja kaksi runsainta y-Ionia tandem-MS: ssä valittiin havaitsemiseksi.

back to top

Protein Identification XC Score Coverage (%) Protein Identification XC Score Coverage (%)
1 1 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 120 21 30 Neuronal kinesin heavy chain 10 16
2 Apolipoprotein A-IV precursor 90 47 31 WIP-related protein 10 24
3 Alpha-1-antichymotrypsin precursor 40 24 32 ATP-binding cassette sub-family F 10 15
4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 40 15 33 NAD(P)H dehydrogenase 1 10 6
5 Afamin precursor 40 24 34 Inhibin beta A chain precursor 10 33
6 Kininogen-1 precursor 40 23 35 Corticosteroid-binding globulin precursor 10 2
7 Complement factor H precursor 30 16 36 Neuropeptide FF receptor 1 10 8
8 Serum amyloid P-component precursor 30 35 37 Tripartite motif protein 8 9
9 Histidine-rich glycoprotein precursor 20 15 38 CD180 antigen precursor 8 5
10 Antithrombin-III precursor 20 23 39 CCAAT displacement protein 8 13
11 Gelsolin precursor 20 15 40 Cytoplasmic linker protein 8 15
12 Hemopexin precursor 20 30 41 Eukaryotic translation initiation factor 2 8 25
13 Vitronectin precursor 20 27 42 Sodium channel protein type I alpha subunit 8 5
14 Alpha-2-antiplasmin precursor 20 24 43 Signal peptide peptidase-like 2B 8 9
15 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 20 32 44 Acid ceramidase precursor 8 28
16 Angiotensinogen precursor 10 12 45 Glutamate receptor, ionotropic kainate 3 8 16
17 AMBP protein precursor 10 9 46 Gephyrin 8 14
18 Alpha-2-HS-glycoprotein precursor 10 25 47 ARD1 subunit homolog 8 33
19 F-box only protein 31 10 17 48 Low-density lipoprotein receptor protein 2 8 6
20 Prothrombin precursor 10 14 49 Troponin I, fast skeletal muscle 8 15
21 Plasma protease C1 inhibitor precursor 10 8 50 Integrin alpha-E precursor 8 10
22 Tubulin tyrosine ligase-like protein 4 10 7 51 TSC22 domain family protein 1 6 25
23 Heparin cofactor II precursor 10 11 52 Secretogranin-3 precursor 6 12
24 Beta-2-glycoprotein I precursor 10 17 53 BRCA1-associated protein 6 12
25 Isovaleryl-CoA dehydrogenase 10 8 54 Reelin precursor 4 4
26 BLOC-1 subunit 10 14 55 Threonine synthase-like 1 4 19
27 Pantothenate kinase 3 10 14 56 Ciliary dynein heavy chain 5 2 12
28 Contactin 3 precursor 10 8 57 Sorting nexin-19 2 9
29 Täydentävät C5 esiaste 10 9

Taulukko 1: Proteiinit Tunnistettiin LC-MS/MS Analyysi ProteoPrep® 20 Ehtyminen Näyte (ei yksilöity koko plasma-analyysi). Edellä luetellut proteiinit tunnistettiin varmuudella proteoprep® 20: n tyhjentyneestä näytteestä, eikä niitä havaittu koko plasman LC-MS/MS-analyysissä. ProteoPrep® 20-poistumisteknologian avulla olemme mahdollistaneet näiden proteiinien tunnistamisen ja absoluuttisen kvantifioinnin. Tietoaineistoja haettiin BIOWORKS 3.2: n SEQUEST-algoritmilla. Proteiinihittien suodatus koostui XCORR-arvoista >1,9, 2,2 ja 3,75 yksittäin, kaksin-ja kolmesti varautuneille ioneille sekä Delta CN > 0,1 ja Rsp > 4.

takaisin alkuun

kuva 3: Proteiini-AQUA™ – analyysi albumiinista Kokonaisplasmassa ja ProteoPrep® – liuoksesta 20 tyhjentynyttä näytettä. Selected reaction monitoring (SRM) kohdistuu erityisesti MS-havaitsemiseen valitusta vanhemmasta, joka tuottaa spesifisiä tytärioneja. Kuvissa 3A (kokonainen plasma) ja 3C (tyhjentynyt) kuvataan endogeeninen albumiinipeptidi, FQNALLVR, kaksinkertaisesti varautuneena ionikappaleena, joka tuottaa kaksi runsasta y-Ionia. Näitä samoja y-ioneja seurataan Aqua™ – peptidistandardissa, joka on esitetty kuvissa 3B (koko plasma) ja 3D (köyhdytetty); Aqua-piikissä olevien sekä emo-että tytär-ionien absoluuttinen massavaraus on kuitenkin suurempi johtuen stabiilin isotooppiaminohapon inkorporoitumisesta. Kvantitointi suoritetaan integroimalla tässä esitetyt huippualueet 34, 8 minuutin kohdalla. Näytteiden Protein-AQUA™ – analyysi osoittaa, että albumiinin pitoisuus on 99, 8% ProteoPrep® 20 Plasma Immunodepletion Kit-Valmisteella, mikä vastaa erinomaisesti aiemmin saatuja ELISA-tietoja.

takaisin alkuun

kuva 4: Proteiini-AQUA analyysi Gelsoliinin koko plasman ja ProteoPrep® 20 tyhjentynyt näytteitä. Endogeenisen gelsoliinipeptidin, GASQAGAPQGR: n, SRM-analyysi johtaa kompleksiseen kromatogrammiin koko plasmassa (Kuva 4A), jonka erottelukyky on huono ja signaali kohisee heikosti. Analysoitaessa köyhdytetystä plasmasta (Kuva 4C) endogeeninen gelsoliinipeptidi erotetaan helposti häiritsevistä lajeista ja sen pitoisuus lasketaan helposti vertaamalla Aqua™ – peptidistandardiin (kuvat 4B ja 4D).

back to top

johtopäätökset

Plasmaproteomiikka pitää hyvin lupaavana biomarkkerien löytämisen sekä in vitro-diagnostiikan tulevaisuuden. Vaikka plasma on helposti analysoitavissa, plasman proteomin tutkimista rajoittaa olennaisesti sen laaja dynaaminen alue (10 suuruusluokkaa). Runsasmääräiset proteiinit, joilla on suuri diagnostinen potentiaali, ovat usein hämärän peitossa, koska niissä on runsaasti seerumiproteiineja. Käyttämällä ProteoPrep® 20: tä runsaimpien proteiinien ehtymiseen, olemme mahdollistaneet lukuisten vähemmän runsaiden proteiinien tunnistamisen ja absoluuttisen kvantifioinnin ihmisen seerumista. Uskomme, että tämä teknologioiden yhdistelmä voi mahdollisesti tarjota moninaisen kohdennetun lähestymistavan sellaisten proteiinien löytämiseen, joilla on biologista tai diagnostista merkitystä.

takaisin huipulle

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.