Quantification Absolue du Protéome Sérique

Jeffrey J. Porter, Justin Wildsmith, Christopher D. Melm, Mark D. Schuchard, Kevin M. Ray, Dian Er Chen et Graham B.I. Scott

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Résumé
Introduction
Faits sur le plasma
Méthodes
Résultats
Conclusions

Résumé

La protéomique plasmatique est très prometteuse pour l’avenir de la découverte de biomarqueurs, ainsi que du diagnostic in vitro. Bien que le plasma soit facilement accessible pour l’analyse, l’étude du protéome plasmatique est fondamentalement limitée par sa vaste gamme dynamique (10 ordres de grandeur). Les protéines à faible abondance, porteuses d’un grand potentiel diagnostique, sont souvent obscurcies par la présence de protéines sériques à forte abondance. Afin de résoudre ce problème, nous avons développé le ProteoPrep® 20, une résine à base d’anticorps capable d’épuiser 97 à 98% de la protéine totale du plasma. La déplétion de ces protéines à haute abondance permet de visualiser des protéines co-éluant avec, et masquées par, les protéines et peptides à haute abondance, en utilisant des méthodes LC-MS. La quantification absolue (Protein-AQUA ™) est une technique de protéomique quantitative ciblée qui présente une efficacité robuste et est de plus en plus utilisée pour une grande variété d’études de protéomique quantitative. En appliquant le ProteoPrep® 20 pour la déplétion des protéines les plus abondantes, nous avons permis l’identification et la quantification absolue de nombreuses protéines à faible abondance à partir du sérum humain. Nous pensons que cela peut potentiellement fournir une approche ciblée multiplexée pour la découverte de protéines ayant une signification biologique ou diagnostique.

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Introduction

L’étude du protéome plasmatique humain est un domaine d’un grand intérêt, en particulier pour le potentiel pharmaceutique d’identification des biomarqueurs de maladies. De nombreuses protéines d’intérêt pharmaceutique apparaissent à de faibles concentrations dans le plasma et sont donc difficiles à détecter. L’identification des biomarqueurs potentiels est particulièrement difficile en raison de la présence de protéines à plus forte abondance. La déplétion de ces protéines à haute abondance permet de visualiser des protéines co-éluant avec, et masquées par, les protéines et peptides à haute abondance, en utilisant des méthodes LC-MS. En éliminant les protéines à forte abondance, des charges plus élevées de protéines plasmatiques à faible abondance peuvent ensuite être séparées sur des colonnes de phase inverse, permettant la détection et la quantification de protéines à faible nombre de copies. Le kit d’immunodépression plasmatique ProteoPrep® 20 a été développé pour l’élimination de 20 protéines à forte abondance de 8 mL de plasma. La déplétion de ces 20 protéines à forte abondance élimine plus de 97% des protéines plasmatiques et permet l’analyse de 20 à 50 fois plus de chaque protéine individuelle pour une meilleure visualisation des protéines à faible nombre de copies. En appliquant le ProteoPrep® 20 pour la déplétion des 20 protéines les plus abondantes, nous avons permis l’identification et la quantification absolue de nombreuses protéines à faible abondance du sérum humain.

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Faits sur le plasma

  • Les 10 protéines les plus abondantes représentent environ 90% de la masse protéique totale du plasma humain.
  • Les 22 protéines les plus abondantes représenteraient environ 99% de la masse protéique totale du plasma humain.
  • La colonne d’immunodéplétion plasmatique ProteoPrep® 20 élimine les 20 protéines plasmatiques/sériques à forte abondance énumérées ci-dessous. Ces 20 protéines représentent environ 97% de la masse totale de protéines plasmatiques humaines.

20 Most Abundant Plasma Proteins
Albumin α-2-Macroglobulin Apolipoprotein A1 Complement C4
IgGs IgMs Apolipoprotein A2 Complement C1 q
Transferrin α-1-Antitrypsin Apolipoprotein B IgDs
IgAs Haptoglobin Ceruloplasmin Plasminogen

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Méthodes

Épuisement des protéines à Haute abondance
Vingt protéines à haute abondance ont été appauvries du plasma en utilisant le Kit d’immunodépression ProteoPrep® 20 (PROT20). Une grande colonne de spin prototype de 3,7 mL capable d’épuiser 100 mL de plasma humain a été utilisée. La concentration en protéines du plasma entier et appauvri a été déterminée à l’aide du test de Bradford (B6916), avec BSA comme étalon.
Digestion tryptique
Des échantillons de plasma entier et appauvri ont été préparés en aliquotes de 100 mg. Chaque échantillon a été dilué à 0,25 mg/mL dans du tampon bicarbonate d’ammonium. L’acétonitrile a été ajouté à une concentration finale de 9% (v / v), et chaque échantillon a été réduit et alkylé à l’aide du kit de réduction/ alkylation ProteoPrep® (PROTRA). La trypsine de qualité protéomique (T6567) a été ajoutée à une concentration de 1% (p/ p) et l’échantillon a été incubé pendant 3 heures à 37 ° C. Une aliquote supplémentaire de trypsine à 1% (p/ p) a été ajoutée, puis l’échantillon a encore incubé à 37 °C pendant une nuit. Les digestes ont été séchés jusqu’à leur achèvement dans un SpeedVac™.
Analyse LC-MS/MS
Une injection d’un échantillon de plasma appauvri en ProteoPrep® 20 à digestion tryptique (préparé comme décrit dans les Méthodes) a été réalisée à l’aide d’un capillaire Agilant 1100 HPLC. La séparation de phase inverse a été réalisée sur une colonne Discovery C18 de 15 cm × 2,1 mm, en utilisant un gradient de 3 heures. La phase mobile est constituée d’eau acidifiée formique et d’acétonitrile. Le système de séparation a été couplé à un spectromètre de masse à piège à ions linéaire Thermo Finnigan LTQ pour effectuer une MS en tandem sur les dix ions les plus abondants de chaque spectre de balayage complet. Après avoir obtenu des résultats de MS en tandem sur un ion d’intérêt, il a été ajouté à une liste d’exclusion pour faciliter l’interrogation des ions à faible abondance. Une méthode LC-SRM a été développée correspondant aux cibles protéiques albumine (peptide idéotypique = FQNALLVR) et gelsoline (peptide idéotypique = GASQAGAPQGR), comme indiqué dans la section Résultats.
Analyse AQUA
Une solution mère peptidique AQUA™ a été préparée en dissolvant des versions marquées isotopiquement des deux peptides cibles (respectivement FQNALLVR* et GASQAGAPQGR*) dans 0,1% de TFA à une concentration finale de 62,5 fmol/mL. Chaque échantillon digéré (plasma entier et appauvri) a été dissous dans 20 mL de la solution mère peptidique AQUA™. Les échantillons ont été analysés à l’aide d’une CLHP capillaire Agilent 1100 couplée à un spectromètre de masse à piège à ions linéaire Thermo Finnigan LTQ. En utilisant une méthode LC-SRM, la quantité absolue de chaque peptide (et de la protéine correspondante) a été déterminée.

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Results

Select an optimal tryptic peptide and stable isotope amino acid from the sequence of your protein of interest.
Order synthetic AQUA™ Peptide from.
Optimize LC-MS/MS separation protocol for quantitation.
Extract protein from biological samples and add known quantity of AQUA™ peptide.
Digest.
Analyser par LC-MS/MS ou MALDI pour quantifier la protéine d’intérêt.

Figure 1: Aperçu de la méthode Protein-AQUA™. Cette méthode a été développée par le Dr Steve Gygi et ses collègues de la Harvard Medical School. L’utilisation limitée de cette méthode est autorisée en vertu d’un accord de licence avec la Harvard Medical School.

Cliquez sur l’image pour l’agrandir.

Figure 2: Développement d’une protéine-AQUA™ LC-SRM pour la Quantification Absolue des Protéines. Une injection d’un échantillon de plasma appauvri en ProteoPrep® 20 à digestion tryptique (préparé comme décrit dans les Méthodes) a été réalisée à l’aide d’une CLHP capillaire Agilent 1100 couplée à un spectromètre de masse à piège à ions linéaire Thermo Finnigan. Le chromatogramme de crête de base (figure 2A) montre un mélange complexe d’espèces qui peuvent ou non avoir été résolues chromatographiquement. En exploitant la puissance de la SEP en tandem, plus de 100 protéines ont été identifiées positivement, avec confiance, à partir de l’échantillon de plasma appauvri. Deux de ces protéines (l’albumine et la gelsoline) ont été choisies pour une étude plus approfondie. La MS de balayage complet illustrée à la figure 2B illustre la forte abondance de l’ion doublement chargé de 481 Da provenant de l’un des peptides d’albumine identifiés. Cette séquence est ensuite confirmée sur la figure 2C avec une abondance d’ions y et b. Cette approche expérimentale jette les bases du choix d’un peptide AQUA™ approprié en plus de fournir les informations nécessaires à la conception de l’expérience SRM. Comme le montrent les figures 2B et 2C, l’ion parent doublement chargé de ce peptide d’albumine spécifique a été sélectionné pour la fragmentation et les deux ions y les plus abondants présents dans la MS en tandem ont été sélectionnés pour la détection.

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Protein Identification XC Score Coverage (%) Protein Identification XC Score Coverage (%)
1 1 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 120 21 30 Neuronal kinesin heavy chain 10 16
2 Apolipoprotein A-IV precursor 90 47 31 WIP-related protein 10 24
3 Alpha-1-antichymotrypsin precursor 40 24 32 ATP-binding cassette sub-family F 10 15
4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 40 15 33 NAD(P)H dehydrogenase 1 10 6
5 Afamin precursor 40 24 34 Inhibin beta A chain precursor 10 33
6 Kininogen-1 precursor 40 23 35 Corticosteroid-binding globulin precursor 10 2
7 Complement factor H precursor 30 16 36 Neuropeptide FF receptor 1 10 8
8 Serum amyloid P-component precursor 30 35 37 Tripartite motif protein 8 9
9 Histidine-rich glycoprotein precursor 20 15 38 CD180 antigen precursor 8 5
10 Antithrombin-III precursor 20 23 39 CCAAT displacement protein 8 13
11 Gelsolin precursor 20 15 40 Cytoplasmic linker protein 8 15
12 Hemopexin precursor 20 30 41 Eukaryotic translation initiation factor 2 8 25
13 Vitronectin precursor 20 27 42 Sodium channel protein type I alpha subunit 8 5
14 Alpha-2-antiplasmin precursor 20 24 43 Signal peptide peptidase-like 2B 8 9
15 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 20 32 44 Acid ceramidase precursor 8 28
16 Angiotensinogen precursor 10 12 45 Glutamate receptor, ionotropic kainate 3 8 16
17 AMBP protein precursor 10 9 46 Gephyrin 8 14
18 Alpha-2-HS-glycoprotein precursor 10 25 47 ARD1 subunit homolog 8 33
19 F-box only protein 31 10 17 48 Low-density lipoprotein receptor protein 2 8 6
20 Prothrombin precursor 10 14 49 Troponin I, fast skeletal muscle 8 15
21 Plasma protease C1 inhibitor precursor 10 8 50 Integrin alpha-E precursor 8 10
22 Tubulin tyrosine ligase-like protein 4 10 7 51 TSC22 domain family protein 1 6 25
23 Heparin cofactor II precursor 10 11 52 Secretogranin-3 precursor 6 12
24 Beta-2-glycoprotein I precursor 10 17 53 BRCA1-associated protein 6 12
25 Isovaleryl-CoA dehydrogenase 10 8 54 Reelin precursor 4 4
26 BLOC-1 subunit 10 14 55 Threonine synthase-like 1 4 19
27 Pantothenate kinase 3 10 14 56 Ciliary dynein heavy chain 5 2 12
28 Contactin 3 precursor 10 8 57 Sorting nexin-19 2 9
29 Complément précurseur C5 10 9

Tableau 1 : Protéines identifiées dans l’analyse LC-MS/MS de l’échantillon de déplétion de ProteoPrep® 20 (non identifiées dans l’analyse plasmatique complète). Les protéines énumérées ci-dessus ont été identifiées avec confiance dans l’échantillon appauvri en ProteoPrep® 20 et n’ont pas été détectées dans l’ensemble de l’analyse LC-MS/ MS plasmatique. En utilisant la technologie de déplétion ProteoPrep® 20, nous avons permis l’identification et la quantification absolue de ces protéines. Les ensembles de données ont été recherchés à l’aide de l’algorithme de SÉQUESTRATION dans Bioworks 3.2. La filtration des hits protéiques consistait en des valeurs XCORR > 1,9, 2,2 et 3,75 pour des ions chargés individuellement, doublement et triplement, ainsi que delta CN > 0,1 et Rsp > 4.

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Figure 3: Analyse Protein-AQUA™ de l’Albumine dans le Plasma Entier et des échantillons appauvris en ProteoPrep® 20. La surveillance de réaction sélectionnée (SRM) cible spécifiquement la détection de MS du parent sélectionné qui produit des ions filles spécifiques. Les figures 3A (plasma entier) et 3C (appauvri) représentent le peptide d’albumine endogène, FQNALLVR, comme fragment d’ions doublement chargés pour produire deux ions y abondants. Ces mêmes ions y sont surveillés dans le standard peptidique AQUA™ illustré aux figures 3B (plasma entier) et 3D (appauvri); cependant, la masse absolue à charge des ions parents et filles dans le spike AQUA est de masse plus élevée en raison de l’incorporation d’un acide aminé isotopique stable. La quantification est effectuée en intégrant les zones de pic de co-élution indiquées ici à 34,8 minutes. L’analyse Protein-AQUA™ des échantillons indique une déplétion de 99,8% de l’albumine à l’aide du kit d’immunodépression plasmatique ProteoPrep® 20, ce qui est en excellente concordance avec les données ELISA précédemment obtenues.

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Figure 4: Analyse des Protéines-AQUA de la Gelsoline dans le Plasma Entier et des échantillons appauvris en ProteoPrep® 20. L’analyse SRM du peptide de gelsoline endogène, GASQAGAPQGR, aboutit à un chromatogramme complexe dans le plasma entier (Figure 4A) avec une mauvaise résolution et un faible rapport signal/bruit. Lorsqu’il est analysé dans un plasma appauvri (Figure 4C), le peptide de gelsoline endogène est facilement séparé des espèces interférantes et sa concentration est facilement calculée par comparaison avec l’étalon interne du peptide AQUA™ (Figures 4B et 4D).

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Conclusions

La protéomique plasmatique est très prometteuse pour l’avenir de la découverte de biomarqueurs, ainsi que du diagnostic in vitro. Bien que le plasma soit facilement accessible pour l’analyse, l’étude du protéome plasmatique est fondamentalement limitée par sa vaste gamme dynamique (10 ordres de grandeur). Les protéines à faible abondance, porteuses d’un grand potentiel diagnostique, sont souvent obscurcies par la présence de protéines sériques à forte abondance. En appliquant le ProteoPrep® 20 pour la déplétion des protéines les plus abondantes, nous avons permis l’identification et la quantification absolue de nombreuses protéines à faible abondance à partir du sérum humain. Nous pensons que cette combinaison de technologies peut potentiellement fournir une approche ciblée multiplexée pour la découverte de protéines ayant une signification biologique ou diagnostique.

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